此外，當以KIRREL3 siRNA、CNTN4 副甲狀腺癌2023 siRNA、或CD351 siRNA處理時，對肺癌細胞之細胞毒性亦明顯增加。 在以抗體或siRNA培養PBMCs與癌細胞之混合物24小時後，細胞以7-胺基放線菌素D (7-AAD；BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)染色，以檢測溶解的細胞。 測定FL-1 與FL-3 (7-AAD)染色，以分析PBMC對癌細胞之細胞毒性，其使用FACSDiVa軟體。
在一具體實施例中，相較於未以KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑處理的癌細胞，KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑可去活化KIRREL3、CNTN4、及/或CD351的功能，或減少其在癌細胞中的活性。 KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑可包括但不侷限於，化合物、胜肽、胜肽擬物、融合蛋白、抗體、適配體等，其特異地結合至KIRREL3、CNTN4、及/或CD351蛋白質。 KIRREL3抑制劑、CNTN4抑制劑、及CD351抑制劑的種類可相同或彼此不同。 如申請專利範園第1項所述之方法，其中於該步驟以及步驟之間，更包含下列步驟：收集未附著的細胞；處理該些細胞以得到一第一沈澱物；利用該配方回溶該第一沈澱物；以及靜置一第二合適時間。 進一步說明的是，上述步驟S1004可藉由一流式細胞檢測技術或一磁珠分選技術來完成。
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較佳地，介白素15號的濃度大於1ng/mL，更進一步，介白素15號的濃度為10 ng/mL。 抗原呈現細胞的功能是攝取、加工、處理外源性抗原並將加工後抗原呈現給T淋巴細胞，誘導T淋巴細胞進行增殖進而分化成效應細胞，產生免疫反應，以辨識並抵抗感染甚至癌症細 胞。 樹突細胞(Dendritic cells，DCs)是目前所知的人體內功能最強大的抗原呈現細胞，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。 DC的最大特點是能夠顯著刺激初始T細胞進行增殖，而其他的抗原呈現細胞，如巨噬細胞、B細胞僅能刺激已活化的或記憶性T細胞。
更進一步，介白素15號的濃度為10 ng/mL，介白素12號的濃度為0.5-20ng/mL。 利用本發明所提供之配法可將人類血液檢體中之毒殺型樹突細胞的數量擴增200至400倍。 本發明之另一態樣為提供受試者一種治療或預防癌症的方法，其包含投予受試者一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。 同時，本發明之另一態樣為提供受試者一種增強免疫的方法，其包含投予受試者一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。 在彼等方法中，除非另有特別說明，否則相關術語與上述醫藥組合物所解釋之術語具有相同含義。 本發明提供一種用於治療或預防癌症的醫藥組合物，其包含一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑，以及一種治療或預防癌症的方法，其係係向有需求之受試者投予一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。
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下表1為未處理對照組與用四個阻斷KIRREL3之中和抗體之第一組至第四組，且下表2為未處理對照組與用三個減量KIRREL3之siRNAs之第五組至第七組。 將肺癌細胞株A549、結腸癌細胞株HCT-116、乳癌細胞株MDA-MB-231、胃癌細胞株MKN-74、及白血病細胞株U937分別與1 μL之CFSE (羧基螢光素琥珀醯亞胺基酯)混合，之後保存在37°C下3分鐘。 以30 mL之FACS緩衝液加入所得物、移液、及離心以移除上清液。 接著，加入10% FBS RPMI1640、移液、及離心以移除上清液。 之後，以10 mL之10% FBS RPMI1640混合所得物，並計數細胞數目。
- 將數目3x104個細胞的癌細胞加入實施例2.1製備之含有PBMC之96孔培養盤各孔中，其體積為100 μL。
- 另外，上述步驟S107亦可於步驟S102靜置一第一合適時間後執行。
- 實施例 雖然下文詳述本發明多個實施例之配方及培養方法，但應瞭解本發明可提供許多可在多種具體背景下實施的實用發明概念。
- KIRREL3抑制劑、CNTN4抑制劑、及CD351抑制劑的種類可相同或彼此不同。
- 另外，自然殺手細胞也是一種在免疫反應中佔有重要地位的細胞，其起源於淋巴前驅細胞，佔人類血液中淋巴球的5~10%。
如申請專利範園第1項所述之方法，其中該分離出之該毒殺型樹突細胞的數量，為人類血液檢體中篩選出之毒殺型樹突細胞數量的200至400倍。 如本發明所使用，符號「-」係指細胞表面標記沒有表現於細胞表面，如利用流式細胞儀測得細胞表面標記量等於陰性控制組的表現量。 如本發明所使用，符號「+」係指細胞表面標記有表現於細胞表面，如利用流式細胞儀測得細胞表面標記量大於陰性控制組的表現量。 如請求項1所述之用於治療或預防癌症的醫藥組合物，其中該抑制劑為反義核酸、siRNA、shRNA、miRNA、或核糖核酸酵素，其以互補方式結合至KIRREL3、CNTN4、及CD351基因之一或多者的DNA或mRNA。 如第八圖A至第十一圖D、第十三圖A至第十六圖D、及第十八圖A至第二十一圖D所示，當以抗體或siRNAs中和KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者時，在結腸癌、乳癌、胃癌、及白血病亦觀察到增加PBMC細胞毒性的結果。 當以KIRREL3中和抗體、CNTN4中和抗體、或CD351中和抗體處理肺癌細胞株A549與PBMC時，相較於未處理對照組，對肺癌細胞之細胞毒性明顯增加，其取決於抗體類型，存在或多或少程度上之差異。
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第十二圖A、第十二圖B、第十二圖C、及第十二圖D顯示以CNTN4抑制劑處理肺癌細胞株A549與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十圖A、第十圖B、第十圖C、及第十圖D顯示以KIRREL3抑制劑處理胃癌細胞株MKN-74與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第九圖A、第九圖B、第九圖C、及第九圖D顯示以KIRREL3抑制劑處理乳癌細胞株MDA-MB-231與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第八圖A、第八圖B、第八圖C、及第八圖D顯示以KIRREL3抑制劑處理結腸癌細胞株HCT-116與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第七圖A、第七圖B、第七圖C、及第七圖D顯示以KIRREL3抑制劑處理肺癌細胞株A549與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。
- 本實施例旨在確認，當以KIRREL3、CNTN4、或CD351抑制劑中和KIRREL3、CNTN4、或CD351時，是否抑制小鼠腫瘤生長。
- 如本發明所使用，符號「-」係指細胞表面標記沒有表現於細胞表面，如利用流式細胞儀測得細胞表面標記量等於陰性控制組的表現量。
- 候選抗癌劑較佳為可抑制KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之表現及/或活性的物質。
- 在彼等方法中，除非另有特別說明，否則相關術語與上述醫藥組合物所解釋之術語具有相同含義。
接著，以10 副甲狀腺癌2023 mL之10% FBS RPMI1640混合所得物，並計數細胞數目。 測定KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之mRNA表現量的方法可包括但不侷限於，本領域常規習知之任何方法，如反轉錄酶PCR、競爭性反轉錄酶PCR、即時反轉錄酶PCR、RNase保護試驗、北方墨點法、DNA晶片、或RNA晶片。 口服投予之載體可包括，例如，乳糖、澱粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。 非口服投予之載體可包括，例如，水、合適之油類、生理鹽液、葡萄糖水溶液、乙二醇類等。 醫藥上可接受安定劑可包括，例如，抗氧化劑，如硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、或抗壞血酸。 醫藥上可接受防腐劑可包括，例如，氯化烷基二甲基苄基銨、對羥苄酸甲酯或對羥苄酸丙酯(methyl- or propyl-paraben)、氯丁醇等。
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本實施例旨在確認，KIRREL3、CNTN4、及CD351是否抑制T細胞之增生與活性，並確保癌細胞逃避T細胞介導之免疫系統。 「候選抗癌劑」乙詞可指核酸、蛋白質、抗體、化合物、萃取物、或天然物質，依據常規選擇方法，可隨機選定或認定能抑制KIRREL3、CNTN4、及/或CD351的表現或活性。 候選抗癌劑較佳為可抑制KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之表現及/或活性的物質。 本發明醫藥組合物或醫藥組合物之活性成分含量的適用劑量，可由本領域之普通技術人員衡量各因素而定，例如投予途徑、投予次數、病患年齡、體重、健康、性別、疾病嚴重程度、飲食、及排泄率等。
此類TCR分子應具備高靈敏度傳感器的功用，其需要辨識抗原的極微小變化，並轉移訊息。 副甲狀腺癌 若抗原特異性後天免疫系統無法正常運作，則移除癌細胞的能力會有嚴重問題。 舉例而言，若癌細胞表面上的蛋白質PD-L1或PD-L2結合至T細胞表面上的蛋白質PD-1，則T細胞無法攻擊癌細胞。
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近年來，同時具有上述兩種DC與NK細胞功能的干擾素分泌型殺手樹突細胞逐漸受到關注。 干擾素分泌型殺手樹突細胞可以從毒殺目標、抗原呈現到活化T細胞都由自己完成，亦即干擾素分泌型殺手樹突細胞找到目標後會毒殺目標，接著把碎片吞噬後呈現抗原給T細胞，並活化T細胞。 人體對外來異物具有辨識和啟動一連串反應的防禦機轉，這防禦系統就是免疫系統。
其他醫藥上可接受載體可為彼等揭示於「Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th 副甲狀腺癌2023 ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995」文獻者。 「胜肽擬物」乙詞意指一胜肽或非胜肽，其抑制能誘導KIRREL3、CNTN4、及/或CD351活性之KIRREL3、CNTN4、及CD351蛋白質之一或多者的結合結構域。 「shRNA (短髮夾型RNA)」乙詞意指單股RNA，包含一莖部分，其經由氫鍵形成雙股部分，以及一環部分。 其由蛋白質，如切丁酶，加工轉化成siRNA，並進行與siRNA相同的功能。
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因此，本發明之KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑在治療或預防癌症上極有效。 然而，必須說明的是，在一較佳實施例中，上述配方雖更可包含介白素12號，但僅包含有介白素15號的配方已可達到良好之培養效果，不僅如此，此配方一定要具有介白素15號，加入介白素12號是可更進一步加強其放大培養效果。 請參考第五A至五D圖，第五A至五D圖分別顯示加入培養基(對照組)、介白素12號、介白素15號與介白素15號搭配介白素12號，培養毒殺型樹突細胞至第三天的結 果。 據此，本發明所提供之培養毒殺型樹突細胞的配方係包含細胞激素，且此處所指的細胞激素可為單獨使用有效量之介白素15號，或同時使用有效量之介白素15號與介白素12號，本發明並不欲以任一實施例為限。 至於，配方中所使用的介白素15號與介白素12號的濃度與培養方法均已描述如前文，在此不再贅述。 在本發明之一實施例中，其中於上述靜置第一合適時間後，更包含下列步驟：首先，收集未附著的細胞，該些細胞經處理後得到一第一沈澱物。
第十九圖A、第十九圖B、第十九圖C、及第十九圖D顯示以CD351抑制劑處理乳癌細胞株MDA-MB-231與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十八圖A、第十八圖B、第十八圖C、及第十八圖D顯示以CD351抑制劑處理結腸癌細胞株HCT-116與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十七圖A、第十七圖B、第十七圖C、及第十七圖D顯示以CD351抑制劑處理肺癌細胞株A549與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十五圖A、第十五圖B、第十五圖C、及第十五圖D顯示以CNTN4抑制劑處理胃癌細胞株MKN-74與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十四圖A、第十四圖B、第十四圖C、及第十四圖D顯示以CNTN4抑制劑處理乳癌細胞株MDA-MB-231與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十三圖A、第十三圖B、第十三圖C、及第十三圖D顯示以CNTN4抑制劑處理結腸癌細胞株HCT-116與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。
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其表現在胎兒與成人腦中，以及腎小球之足細胞中，且據報導其參與腎臟的血液過濾功能及突觸形成。 如申請專利範園第5項所述之方法，其中該收集該人類血液檢體的步驟中之該人類血液檢體，係來自於一癌症患者。 如本發明所使用，術語「介白素」係指一組細胞因子，可以由多種細胞產生，人體免疫系統的功能在很大程度上依賴於介白素。 本領域技術人員將理解到，或者能使用不超過常規之實驗，確定本文所述之本發明特定具體實施例的許多等同物。
「反義核酸」乙詞意指DNAs或RNAs含有互補於特定mRNA或其片段或衍生物之序列的核酸序列，其與mRNA互補序列結合或雜交，並抑制mRNA轉譯成蛋白質。 「CD351 (分化集群351)」乙詞意指一Fc受體，其以高親和力結合至IgA與IgM，且亦稱作「Fcα/μR」。 據報導，在小鼠中，該受體表現在巨噬細胞、濾泡樹突細胞、邊緣區與濾泡B細胞、及腎小管上皮細胞。 據報導，在人體中，其表現在腸固有層細胞、潘氏細胞、扁桃體濾泡樹突細胞、活化型巨噬細胞、及一些類型之前胚中心IgD+/CD38+ B細胞。 「CNTN4 (接觸蛋白-4)」乙詞意指由CNTN4基因編碼之蛋白質，其隸屬免疫球蛋白超家族。
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本發明之另一目的在於提供一種培養毒殺型樹突細胞的方法，該方法至少包含下列步驟。 接著，加入有效量之該配方以與週邊血單核細胞群組混合，其 中上述配方包含有效量之至少一細胞激素，且上述細胞激素為介白素15號。 有鑑於此，發明人經過長年的努力以及無數次的試驗，已成功篩選出了人類體內同時具有毒殺及抗原呈現功能的細胞，並定義該細胞為毒殺型樹突細胞。 副甲狀腺癌2023 然而，從發明人實驗的結果嚴格說來，毒殺型樹突細胞在人類周邊淋巴細胞中所佔的比率低於0.01%。
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KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑阻斷存在於癌細胞中的KIRREL3、CNTN4、及/或CD351活性，從而抑制T細胞無法透過KIRREL3、CNTN4、及/或CD351攻擊癌細胞的機制，並維持T細胞對癌細胞的免疫活性。 或者，KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑特異地結合至KIRREL3、CNTN4、及/或CD351蛋白質，並干擾KIRREL3、CNTN4、及/或CD351結合至T細胞。 或者，KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑抑制KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之特定代謝途徑，以減少蛋白質之表現，或造成KIRREL3、CNTN4、及/或CD351變性，以使蛋白質失去其活性。
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可由本發明之醫藥組合物治療或預防的癌症包括但不侷限於，胃癌、肺癌、肝癌、結腸直腸癌、結腸癌、小腸癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、黑色素瘤、乳癌、硬化性腺病、子宮癌、子宮頸癌、頭頸癌、食道癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎癌、肉瘤，前列腺癌、尿道癌、膀胱癌、血癌、白血病、淋巴瘤、纖維腺瘤等。 「siRNA (小型干擾性RNA)」乙詞意指短的雙鏈RNA，其能通過切割特定mRNA而誘導RNAi (RNA干擾)。 SiRNA包含一正義RNA鏈，其具有與標的基因之mRNA同源的序列，以及一反義RNA鏈，其具有與其互補的序列。 SiRNA可抑制標的基因的表現，因此可用於基因剔除、基因治療等等。 另外，介白素15號較佳地濃度為10ng/mL，但在發明人的實驗中，介白素15號的濃度大於1ng/mL即可有放大培養毒殺型樹突細胞的效果，而較佳地介白素12號濃度介於0.5-20 ng/mL之間。 如請求項6所述之用於增強免疫的醫藥組合物，其中該受試者有預防、治療、或改進與免疫缺陷、免疫功能下降、免疫系統損傷、或免疫功能受損相關之疾病的需求。
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據報導，其為多醣磷脂肌醇錨定之神經元膜蛋白，作用為細胞黏附分子，並參與神經系統發育過程中的軸突連接形成。 上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本發明之專利範圍中。 名詞定義 除非有其他定義，所有在此所用的技術及科學詞彙，如同作為本發明所屬技術領域中具有一般技藝者一般性地了解具有相同意義。 在此指稱的所有專利、申請案、公開申請案及其他應用，以及基因庫登錄號皆完整以參考文獻被整合起來。 若本章節提出的定義與其他專利、申請案、公開申請案及其他在此引用的參考文獻所提出的定義相反或不一致，以本章節提出的定義為主。
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免疫系統擁有不同作用的白血球及淋巴細胞、不同功能的蛋白質因子，如免疫球蛋白、介白質及細胞激素等，互相協調合作，形成人體的防禦力。 先天性免疫系統包括可溶性化學因子、干擾素、補體系統、嗜中性淋巴球及巨噬細胞的吞噬作用和自然殺手細胞的毒殺作用等。 後天性免疫系統包括體液免疫及細胞免疫，前者包括抗體生成系統，後者包括淋巴細胞、淋巴激素及免疫記憶系統。 記憶的功能使免疫系統對已對付過的抗原，引發強而快速的次發反應，可將外來危害因子有效去除。 第二十圖A、第二十圖B、第二十圖C、及第二十圖D顯示以CD351抑制劑處理胃癌細胞株MKN-74與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 相較於未處理對照組，在KIRREL3、CNTN4、或CD351減量的組別中，明顯抑制小鼠腫瘤生長率。
在本發明之一實施例中，其中上述取得人類血液檢體之周邊血單核細胞群組的步驟中，包含下列步驟。 首先，收集該人類血液檢體，並以同體積磷酸緩衝液兩倍稀釋人類血液檢體。 接著，自人類血液檢體中分離出週邊血單核細胞群組，並去除週邊血單核細胞群組中的T細胞與B細胞。
首先，事先說明的是，如前文所述發明人經過長年的努力以及無數次的試驗，已成功篩選出了人類體內同時具有毒殺及抗原呈現功能的細胞，並定義該細胞為毒殺型樹突細胞，即係具有包含有細胞表面標記為HLA-G-CD14-CD19-CD3-CD56+HLA-DR+的細胞。 在此，較低(或明顯較低)量可代表其量減少5%至95% (如，10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、及90%)。 減少之量亦可指KIRREL3、CNTN4、及CD351之各減少量或KIRREL3、CNTN4、及CD351之單獨減少量的總和。 未以候選抗癌劑處理之組別可為癌細胞，其中不添加物質，或處理除了一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑以外的任何物質如抗癌劑。 接著，請參考第七圖，第七圖顯示CytoDC培養天數及細胞數量的結果。
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如第六B圖與第六C圖所示，隨這培養天數增加，細胞群20會增生並往右上角移動，也就是轉變成同時具有自然殺手細胞表面標記(CD56+)與樹突細胞表面標記(HLA-DR+)的的毒殺型樹突細胞10。 足以說明，本發明提供的培養配方及方法可以放大毒殺型樹突細胞，不只原本的毒殺型樹突細胞會增生更可趨化自然殺手細胞轉變成毒殺型樹突細胞。 請參考第四圖，上述步驟S100更包含下列步驟：首先，收集人類血液檢體S1001，並以兩倍磷酸緩衝液稀釋人類血液檢體S1002。 副甲狀腺癌2023 接著，自人類血液檢體中分離出週邊血單核細胞群組S1003，並去除週邊 血單核細胞群組中的T細胞與B細胞S1004。 另外，步驟S1003係藉由流式細胞檢測技術或Ficoll-Paque密度梯度離心技術來完成。
此外，本發明提供一種用於增強免疫的醫藥組合物，其包含KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑。 此外，本發明提供一種利用KIRREL3、CNTN4、及/或CD351篩選抗癌劑的方法，以及一種提供利用KIRREL3、CNTN4、及/或CD351分析癌症預後所需資訊的方法。 副甲狀腺癌 接著，將藉由第六A至六C圖以及第七圖來說明經由本發明所提供之配方與方法而大量製備毒殺型樹突細胞的實驗結果。 首先，第六A至六C圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀檢測毒殺型樹突細胞在培養前、培養第三天與培養第七天的結果。 如第六A圖所示，可看出在培養前同時具有自然殺手細胞表面標記(CD56+)與樹突細胞表面標記(HLA-DR+)的細胞數量很少，而第六A圖中央如紡錘狀之細胞群20，為帶有CD56但不具HLA-DR的自然殺手細胞。
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此意指，當阻斷或減量KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者以抑制其活性或表現時，延遲或停止癌症的發展，且抑制癌症發生。 據此，一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑可有效用於預防癌症。 相較於以IgG1處理之對照組，以PD-L1處理之對照組抑制CD4+ T細胞與CD8+ T細胞之增生。
