該載體亦包含載體內允許核酸序列接合之核酸序列，該核酸序列亦在宿主細胞中複製。 腫瘤形成 載體之代表包含質體、黏質體或病毒載體；較佳時，該載體為反轉錄病毒載體。 本文中所使用之「一」可指一個或多個，本文之申請專利範圍中與「包含」字詞之連接使用時，「一」可指一個或一個以上。
在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi無限生長，且於體外從2個細胞生成腫瘤。 現今已有不同的假說提出對於癌起始細胞形成的解釋，例如成人幹細胞/先驅細胞(stem/progenitor cell)的突變或分化細胞獲得類似幹細胞的特性；然而，細胞來源與有關癌起始細胞發展的過程仍然不明。 在K-ras G12D 突變的老鼠模型中，位於支氣管肺泡交界的幹細胞被檢測為經Cre/lox調控之活化後之腺癌的潛在起源。 另一個研究證明受IGF-IR信號介導的Oct-4可與β-胡蘿蔔素及Sox-2形成一複合物，其在肺腺癌中對於癌起始細胞之自我更新與致癌潛能扮演重要的角色。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
為以 免疫螢光染色呈現在C1、E9與C7細胞株之細胞膜中的CAR表現量，在Alex488nm螢光下標記CAR，DAPI為細胞核之標記，插入之圖像為正方形區域內之放大圖。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係進一步搭配一5-氟尿嘧啶。 此方法係將microarray晶片中的抗體與加入該喹唑啉酮衍生物過後的cell lysate相互作用，以挑選與apoptosis相關路徑與蛋白(Antibody Array Kit [#12856]) 。 首先，經由皮下注射1×107之該口腔鱗狀上皮癌細胞進入小鼠(6~8週大雄性NOD/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrlBltw)免疫不完全小鼠)體內，依體重平均分配為3組(DMSO(為Control組)、2.5mg/kg、5mg/kg)。 待腫瘤體積長至90~120mm3時，每2天經由腹腔給100μl之藥(該喹唑啉酮衍生物)一次，並每4天測量一次小鼠體重與腫瘤體積大小，在加藥(該喹唑啉酮衍生物)結束並持續觀察4週後犧牲。 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其表現內皮細胞之表面標記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。
而與口腔癌相關的危險因子包括：吸菸、喝酒、嚼食檳榔、紫外線照射、蛀牙、不當之假牙、不良之口腔衛生、長期的營養不良、病毒的感染等。 腫瘤形成 口腔部位可分為唇、夾黏膜(唇及臉頰的內襯)、牙齒、舌頭下方的口腔底部、前三分之二的舌頭、口腔頂部的前面部分(硬顎)、牙齦及臼齒後方的小區域。 而口腔癌則為上述區域發生異常的增生，侵犯至周邊正常的組織，甚至轉移至身體其它部位，影響正常功能的運作進而危及生命。 腫瘤形成2023 說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。 所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。 端粒酶活性在C1、E9及C7細胞株之第12、20、50代能偵測到，在CAR+/mPSCs則無(圖6)。
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48小時後根據廠商說明書指示操作WST-1試驗測定細胞存活率，細胞存活率以未處理組別之百分比表示，並得到IC50值。 細胞裂解物在RIPA緩衝液中萃取，並利用BCA蛋白質檢測試劑依照製造商之說明定量，等量(30μg)之總蛋白以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，並轉漬到活化的聚偏二氟乙烯膜上。 墨點與共軛辣根過氧化物酶之二級抗體孵育，並以加強之化學冷光偵測器(chemiluminescence detection，Millipore)偵測免疫反應帶(immune-reacted bands)。 本文中使用之「載體」一詞係指一核酸分子，其具有可在宿主細胞分裂之核酸序列。
然，由第3B圖可知，加2.5mg/kg之藥(該喹唑啉酮衍生物)的組別與沒加藥(Control組)的組別相比，2.5mg/kg的組別在第14天(第7次加藥)就可觀察到腫瘤大小比起沒加藥(Control組)的組別已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約30%。 而，5mg/kg的組別則在第12天(第6次加藥)就可觀察到腫瘤大小與沒加藥組別相比已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約41.7%。 腫瘤形成 由此可知，該喹唑啉酮衍生物在小鼠體內可以有效的抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之腫瘤形成能力。 首先，請參閱第2圖，其係本發明之口腔癌細胞之存活率之實驗結果圖。
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本發明證實CAR+/mPSCs可透過Oct-4的過量表現而轉化，並發展為典型的癌起始細胞表型，由CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)亦經測試。 在本文所述的實驗中，轉化細胞之特性係由體外測定法測定，包含細胞週期與端粒酶活性分析、球體形成試驗、CD133表現測定、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及化療抗性試驗。 另外，體內測定法包括重症聯合免疫缺陷小鼠(Severe Combined Immunodeficiency Mice；SCID mice)之限制性稀釋移植及腫瘤轉移試驗，用於進一步研究轉化細胞之特性。 因誘導血管新生能力乃癌起始細胞之另一特性，內皮管道形成試驗及雞胚胎尿絨毛膜(chicken chorioallantoic membrane；CAM)試驗係用於評估轉化細胞之血管新生潛能。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之腫瘤形成能力。 在諸多試驗中，C1細胞株展現最顯著之致瘤行為，包含最高之增生速率、最高之非錨定依賴性群落形成(anchorage-independent colony formation)效率及最高之二級球體形成效率。
若該候選藥物對於癌起始細胞具顯著毒性，則該候選藥物是一種抗癌藥物或是治療癌起始細胞之藥物。 固態腫瘤被認為起因於含有幹細胞族群之器官，這些器官的腫瘤包括癌細胞之異質族群，其增生與形成新腫瘤的能力顯著不同；已報導指出此腫瘤形成能力之差別，例如乳癌細胞及中樞神經系統之腫瘤。 儘管大部分癌細胞的分裂能力有限，近期研究指出一群名為癌幹細胞或癌起始細胞(cancer initiating cells；CICs)的癌細胞群具有廣泛的自我更新及形成新腫瘤之能力；越來越多的證據表明調節正常幹細胞自我更新的途徑於癌幹細胞中不受控制或被改變，導致自我更新之癌細胞不斷擴張且形成腫瘤。 有鑑於口腔癌的預防，診斷及治療，有其未滿足的醫療需求，據此，本發明遂提出一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，以解決習知技術所造成之問題。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係進一步搭配一5-氟尿嘧啶。 喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途 本發明係有關一種喹唑啉酮衍生物，尤其是一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途。
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在一較佳具體實施例中，於CAR+/mPSC中Oct-4之表現量高於正常細胞16倍。 在一更佳實施例中，Oct-4於CAR+/mPSC之表現量高於正常細胞20倍。 在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量，該蛋白質由Oct-4的基因編碼而得。 腫瘤形成 在一更佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。 「抗癌藥物(Anti-cancer drug)」是指包含具有抗腫瘤活性之活性成分的組合物，「抗腫瘤活性」係指一抑制腫瘤生長的效果，一腫瘤細胞毒性及/或腫瘤退化效果。
腫瘤形成能力為6/6、5/6、5/6，其分別對應105、104與103顆C1細胞株注射；此外，低濃度之C1細胞株即足以在平均注射後28天產生腫瘤(4/6)(圖10-i)，腫瘤大小與形態於圖10-ii中呈現。 相反地，利用CAR+/mPSCs細胞移植(106顆細胞)孵育56天仍無法觀察到腫瘤產生(數據未呈現)。 為了檢查轉移潛能，3×105顆C1細胞株經由老鼠之尾端靜脈移植，並讓其發展35天。 肺部組織經蘇木精-伊紅染色法(H&E staining)染色後顯示C1細胞株移植老鼠出現廣泛出血與結節形成，而以CAR+/mPSCs移植之老鼠後並無偵測到異常病變。 利用Kaplan-Meier存活分析得到經C1或CAR+/mPSCs細胞株移植後老鼠的存活率，注射C1細胞株之老鼠平均存活率顯著低於移植CAR+/mPSCs者(圖10)。 這些結果顯示CAR+/mPSCs經Oct-4高量表現後出現惡性轉變，其透過體內與體外之CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株致瘤潛能及腫瘤起始能力實驗皆可得到證實。
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本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係提升該口腔鱗狀上皮癌細胞之促凋亡蛋白之表現。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之週期。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之存活率。 如前所述，依據CAR陽性(CAR-positive)表現量，藉由螢光流式細胞分選儀將CAR+/mPSCs從初代培養細胞分離出來。 以具有編碼Oct-4(SEQ ID NO：1)之反轉錄病毒載體轉染CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)。 簡單而言，反轉錄病毒載體之質體pMXs-mOct-4 與包裹質體(pCMV-gag-pol-PA和pCMV-VSVg)係利用GeneJuice轉染試劑送入HEK293T細胞中，48小時後病毒上清液以0.45μm過濾器過濾，並加入10μg/mL之凝聚胺。
- 因誘導血管新生能力乃癌起始細胞之另一特性，內皮管道形成試驗及雞胚胎尿絨毛膜(chicken chorioallantoic membrane；CAM)試驗係用於評估轉化細胞之血管新生潛能。
- 這些結果證實CAR+/mPSCs之Oct-4高量表現足以產生不朽效果，例如G1細胞週期進程、增生潛能與端粒酶活性。
- 為利用流式細胞儀分析C1、E9與C7細胞株中的CAR陽性之族群。
- 第11天時，雞胚胎尿絨毛膜 以4%三聚甲醛固定，並以立體顯微鏡及數位相機拍照，分支點以NIH Image J軟體及血管新生外掛程式定量。
- 此方法係將microarray晶片中的抗體與加入該喹唑啉酮衍生物過後的cell lysate相互作用，以挑選與apoptosis相關路徑與蛋白(Antibody Array Kit [#12856]) 。
- 細胞以一種乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)抑制劑(二乙基氨基苯甲酮(diethylaminobenzaldehyde；DEAB))處理並作為陰性對照組。
為了評估二級球體形成的效率，C1、E9與C7細胞株於無附著的狀態下培養。 CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之二級球體形成效率顯著高於A549細胞，且於CAR+/mPSCs中亦無球體形成(圖9與表6)，表6顯示細胞群落與球體之定量。 腫瘤尺寸每3天以卡尺測量一次，且體積根據下列標準算式計算：長度×寬度2/2。 在腫瘤轉移試驗中，3×105顆C1細胞株和CAR+/mPSCs經側面尾部靜脈注射至重症聯合免疫缺陷小鼠體內，肺部轉移結節於第五週以屍體解剖及組織學檢查進行評估，利用Kaplan-Meier分析法比較注射C1細胞株與CAR+/mPSCs之小鼠之存活率的差別。 為利用流式細胞儀分析C1、E9與C7細胞株中的CAR陽性之族群。
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再者，請參閱第7圖，其係本發明之口腔癌細胞之染色體變異之實驗結果圖。 結果如第7圖所示， 腫瘤形成2023 利用螢光染色實驗結果發現該喹唑啉酮衍生物可引誘並增加雙極帶錯位染色體 的發生。 顯示隨著加入不同濃度之該喹唑啉酮衍生物，該口腔鱗狀上皮癌細胞之染色體變異程度隨著濃度增加而上升。
軟瓊脂細胞群落形成能力試驗係透過接種3×103顆細胞於35mm之組織培養盤，其包含一層0.35%低熔融瓊脂/ES/MCDB-201覆蓋於一層0.5%低熔融瓊脂/ES/MCDB-201之上。 每隔兩天外加完整培養液，兩週後細胞群落以0.05%結晶紫和甲醇固定，拍攝細胞群落生成並以光學顯微鏡定量。 過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表於CAR+/mPSC中Oct-4之表現量高於正常細胞10倍。
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這些結果證實CAR+/mPSCs之Oct-4高量表現足以產生不朽效果，例如G1細胞週期進程、增生潛能與端粒酶活性。 另外，C1、E9與C7細胞株能繁殖超過50代，其倍增時間為23±1小時(圖6)，在表5中顯示倍增時間。 有數個增生階段其細胞逐漸累積並開始發展異常外觀，是為發育異常階段的出現。 腫瘤形成 口腔癌症狀主要為口腔內潰瘍、硬塊、紅斑、白斑或伴有頸部淋巴腫大、不能張口、咀嚼吞食困難等，初期大都沒有疼痛，當腫瘤變大，局部壞死後可能造成細菌感染以致疼痛異常。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其表現內皮細胞之表面標記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。
- 在一更佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
- 在一更佳具體實施例中，Oct-4於CAR+/mPSC之表現量高於正常細胞20倍。
- 再者，組織學上可將口腔癌區分為鱗狀細胞癌、疣狀癌、小唾液腺癌、肉瘤及惡性黑色素瘤等，其中以鱗狀細胞癌為多數，占口腔惡性腫瘤的90%以上，依次為夾黏膜、牙齦、顎、口底部及口唇部病變。
- 免疫組織化學染色係將此腫瘤切片與相對應之HRP-偶聯之二級抗體在室溫下反應一小時後，利用0.05%之3,3'-二氨基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine；DAB)以肉眼觀察，細胞核以蘇木精複染。
- 因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
- 但其副作用卻極為嚴重，像5-Fu藥物之副作用包含嚴重脫水、骨髓抑制、腸炎、皮炎、心絞痛、急性腎功能不全、肝功能損害、急性中樞神經系統損傷等。
因此，特定的體內測定法，如動物模型之限制性稀釋移植實驗，被用來確認體外測定的結果。 癌起始細胞鑑定的不一致性可能起因於所 研究之細胞源自不同的癌細胞株或成熟腫瘤，臨床腫瘤樣本的表型或功能上的異質性可能加重癌起始細胞鑑定上的困難。 步驟如下：先將該口腔鱗狀上皮癌細胞以2×106顆種5盤在10公分細胞盤中，放入培養箱中24小時使細胞貼附。 最後，將玻片從支架中拿出放入裝有array wash buffer的盒子中，加入適量的LumiGLO及peroxidereagent以顯影，並立即於UVP BioSpectrum AC®Imaging System下拍攝影像。 其中該口腔癌細胞係一口腔鱗狀上皮癌細胞(SAS、OECM-1、CAL27、CAL27-Meta(由實驗室培養))。 又，本發明亦使用非癌細胞：人類永生化角質表皮細胞以及人類口腔纖維細胞來檢測其存活率。
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本發明進一步包含一種確認候選藥物是否為抗癌藥物的步驟，其乃依據步驟中測試化合物抑制效果的結果。 其結果如第4圖，其係本發明之口腔癌細胞之細胞週期之實驗結果圖，在12小時的實驗中可以看到G2/M週期由原本的19.4%增加至38.0%。 顯示當該口腔鱗狀上皮癌細胞有加藥(該喹唑啉酮衍生物)處理時，有加藥之組別相較於正常組別，其週期中G2/M時期的停滯狀況皆有顯著上升的情況，本發明之該喹唑啉酮衍生物能使該口腔鱗狀上皮癌細胞停滯在G2/M時期，並使其走入細胞凋亡(如第5圖)。 接續，分別為本發明之口腔癌細胞之細胞週期之實驗及口腔癌細胞之凋亡之實驗。
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螢光流式細胞分選測量儀藉由綠色螢光通道( nm)用於分析細胞之乙醛脫氫脢活性。 圖16顯示以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞的表面標記，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株於內皮細胞生長培養基中培育7天，接著分析其內皮細胞專一性表面標記之表現，其包括CD31、CD105、CD34及CD144，數字表示陽性表現族群。 在一具體實施例中，本發明進一步包含一步驟後的步驟，是為步驟，其為測試候選藥物對於癌起始細胞之細胞毒 性。
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請參閱第1圖，其係本發明之喹唑啉酮衍生物之化學結構圖，並如第1圖所示，本發明之一喹唑啉酮衍生物(代稱為HoLu)係由苯基喹(phenylquinazolines，PQZ)衍生物進一步加上嗎啉基與苯環(帶F支鏈)形成。 因此，在臨床上常可見到黏膜表面產生變異或不當增生，形成白斑、紅斑、紅白斑、潰瘍、疣狀上皮增生或是口腔黏膜纖維化，以上皆為口腔癌前期之病變可能情況，而上述病變之情況，又可因為長期發炎刺激，進而進一步演變成口腔癌。 口腔癌為當口腔黏膜長期受到危險因子的刺激，會使得基因調控失衡或突變所造成細胞變異。
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C1、E9與C7細胞株在二氯二胺鉑與太平洋紫杉醇處理後亦較CAR+/mPSC展現較低表現量之裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved caspase-3)與裂解凋亡蛋白酶-9(cleaved caspase-9)(圖11-ii)。 總括而言，這些結果顯示Oct-4之高量表現可以驅使CAR+/mPSCs轉型並賦予其似癌起始細胞的特性。 對CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)藉由反轉錄病毒轉染使Oct-4過量表現。
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在一更佳具體實施例中，Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。 在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi表現內皮細胞之表面標記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。 腫瘤形成 針對肺部癌起始細胞，已有不同的生物標識被提出，包含CD133的表現、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及化療 抗性。 在一具體實施例中，CAR+/mPSCOct-4_hi表現CD133、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性及其組合。 該化療抗性意指CAR+/mPSCOct-4_hi對於化學放射治療或化療藥具有抗性。
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在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有腫瘤起始能力。 在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有致瘤能力，其中該致瘤能力包含腫瘤形成、腫瘤再生、轉移能力或其組合。 本發明之CAR+/mPSCOct-4_hi於某些實施例可無限生長，且於體外可從3個細胞生成腫瘤。
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其實驗步驟如同存活率實驗，但於加藥時，先加入該喹唑啉酮衍生物並在5分鐘內再加入5-氟尿嘧啶(5-Fu)。 如申請專利範圍第8項所述之癌起始細胞，其具有藉由活化ANG/Tie2訊息傳遞路徑以加強血管生成的功能。 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有CD133表現、 乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性或其組合。 在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。 所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的 是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。 因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
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癌起始細胞之定義與功能表徵為腫瘤之一小群細胞，其可在體外之適當條件下無限增長(有自我更新能力)，且僅使用少量細胞(2個細胞)即能於活體內形成腫瘤。 其他常見辨識癌起始細胞特性的方法涉及形態學、細胞表面標記之檢查、轉錄圖譜及藥物反應。 在本發明中，證實於CAR+/mPSCs中過量表現多能轉錄因子Oct-4可生成轉化細胞，其稱為CAR+/mPSCsOct-4_hi。 這些轉化細胞具有癌症/腫瘤之起始能力、化療抗性並顯著表現某些促血管新生因子，包括血管生成素(angiopoietins；ANGs)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)，以及增強的血管生成潛能。 此外，CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞標誌，包括CD31、CD105、CD34及CD144。
